pcr引物设计原则 PCR引物设计原则

关于引物设计原则,两种引物可以互补

引物序列的 GC 含量一般为 40-60%，过高或过低都不利于引发反应。

B、每种引物自身不应4、引物自身：不能含有自身互上下游引物的 GC含量不能相太大。补序列，否则会形成发夹样二级结构。存在互补性，B正确；

pcr引物设计原则 PCR引物设计原则

pcr引物设计原则 PCR引物设计原则

D、引物的长度关系到PCR的特异性，D正确．

PCR引物设计原则

故选：C．

引物长度与延伸温度基本呈正比，还影响P引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；CR的特异性。

A、两种引物之间不能有互补性，否则引物之间会配对形成双链DNA，A正确；

引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越短，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越大。一般，如果扩增有一定程度不均一性的序列，则需要28~35个碱基长的寡核苷酸链作引物。

PCR引物问题

你是要问PCR引物设计的原则吗？欢迎追问

①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免Taq DNA聚合酶 2.5u引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非4、引物3’端的碱基一般不用A。特异的扩增条带。

⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性：引物应与序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高引物自身不能有连续4个碱基的互补。会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

pcr产物直接做无缝克隆如何设计引物

PCR引物设计原则

1、引物长度一般在15-30bp。

2、引物GC含量一般为40%-60%。

引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；

Tm值在72℃左右可使复性条件，至少要在55-80℃之间。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor mod)；

引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。

5、引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。

6、引物3’延伸温度一般在酶活性温度附近，从而去调整引物长度。端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。

7、如扩增编码区域，引物3’端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第三位易发生简并，会影响扩增特异性与效率；

8、引物5’端可以修饰。

引物5’端序列对PCR影响不PCR就是聚合酶链式扩增反应，因为DNA是双链，扩增时就需要同时扩增两条链，需要设计上游和下游引物，同时扩增DNA双链因为引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补； 另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，聚合酶可由其3端开始合成新的链。太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。

9、碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。

引物设计的引物设计原则

设计引物应遵循以下原则：

1、长度：15—30bp，其有效长度[Ln=2(G十C)十(A十T)]一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的作用温度(74度)，从而降低产物的特异性。

2、G十C含量：应在40%一60%之间，PCR扩增中的复性温度一般较Tm值低等于引物的Tm值减去5—10度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。

3、碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。十C富集序列区错误引发。

5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。

6、上下游引物的互补性：一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。

7、3’末端：如果可能的话，每个引物的3‘末端碱基应为G或C。

8、引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个核苷酸。

扩展资料

引物设计原理

1、 选择合适的靶序列：设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度保守、碱基分布均匀的区域进行引物设计。

2、 长度：一般来说，寡核苷酸引物长度为 ③引物内部不应出现互补序列。15～30bp。

3、 Tm 值：引物的 Tm 值一般控制在 55～60℃，尽可能保证上下游引物的 Tm 值一致，一般不超过 2℃。若引物中的 G+C 含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退火温度。

5、 碱基的随机分布：引物中四种碱基的分布是随机的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶，尤其在引物的 3’端不应超过 3 个连续的 G 或 C。

6、 引物自身：引物自身不存在连续 4 个碱基以上的互补序列，如回文结构，发夹结构等，否则会影响到引物与模板之间的复性结合，尤其避免 3’末端的互补。

参考资料来源：

参考资料来源：

Primer Premier 5.0引物设计

C、只要设计出目的基因的引物，接下来即可自动进行，而不必知道其全部序列，C错误；

一、PCR引物设计原则

二、Primer Premier 5.0软件设计引物

参照以下real-time PCR引物设计原则：三、引物设计步骤

①输入序列：安装好软件后，首先打开软件，左上角来作，file-new-dna sequence，这一项可以把的序列粘贴进去，也可以选择另一个file-open-dna sequence去open一个新的文件。②点击Primer进入引物设计界面。③点击引物设计界面上的search按钮进行搜索选项设定。④点击搜索选项界2. 产物不能形成二级结构（自由能小于58.61KJ/mol）。面上的OK按钮可得到引物设计结果。⑤选择分值高的引物对作为实验合成引物选项。⑥根据需要对引物进行编辑。

实时荧光定量PCR中两种引物的设计有什么要求

4、 （G+C）含量：有效引物中（G+C）的比例一般为 40～60%。

1.16.TM值在55-63度之间。位于编码区5’端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。

3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相太大。

4.G+C含量在40%~60%之间，45-55％。

5.碱基要随机分布，尽量均匀。

7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。

9. 3’端不要以A结尾，3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。

10. 引物3′端要避开密码子的第3位。

11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能小于9KJ/mol。可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。

12.做荧光定量产物长度80-150bp，最长是300bp.

13.引物设计避免DNA污染，跨外显子接头区。

14.引物与非特异性扩增序列的同源性小于70％或者有8个互补碱基同源。

15.查看有无基因的存 ②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。在。基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。

PCR为什么需要2条引物

8.引物5′端可以修饰。

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构Hairpin使引物本身复性。

3、引物所对应的模板序列的Tm值在72℃左右。

这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。

两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体Dimer与Cross dimer的形成。

引物之间不能有连续4个碱基的互补。

引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高应小于4.5kcal/mol，?G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能。

该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。

扩展资料： 反向引物下游引物是沿着正链进行延长的。

体外扩增DNA，双螺旋是部分或完全打开的，不存在冈崎片段，也不会一段段延长，理论上正反引物都是不间断延长的，和体内DNA自我是有区别的。

正链即有义链，也称编码链，一般位于双链DNA上端，方向从左到右为5'——3'，碱基序列和该基因mRNA基本相同；与该链结合的引物为反向引物； 负链即无义链，也称非编码连，和正链互补，与该链结合的引物为正向引物。

PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。

设计引物时以一条DNA单链为基准常以信息链为基准，5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

ATGC随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。

④两个引物之间不应存在互17. .引物与非特异性扩增序列的同源性小于70％或者有8个互补碱基同源。补序列，尤

如何设置pcr反应体系

标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液 10ul

4种dNTP混合物 各200umol/L

正向引物上游引物是沿着负链进行不间断延长的。

引物 各10～100pmol

引物设计的基本原则： ①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

模板DNA 0.2ug

Mg2+ 1.5mmol/L

加双或三蒸水至 100ul PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度.理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增.设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp,常用为20bp左右.②引物扩增跨度：以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段.③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带.ATGC随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列.④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带.⑤引物3’端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败.⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处.⑦引物的特异性：引物应与序列数据库的其它序列无明显同源性

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